Соглашение о предоставлении субсидии
№14.626.21.0003
от 17.11.2014
№ госрегистрации - 114122540048
Соглашение о субсидии № 14.626.21.0003 от 17.11.2014 г.
Тема: «Создание на основе полногеномного анализа и метаболической инженерии промышленных штаммов микроорганизмов - суперпродуцентов незаменимых аминокислот и их использование в технологиях производства кормовых добавок для сельского хозяйства».
Получатель субсидии / Исполнитель: Федеральное государственное унитарное предприятие «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» (ФГУП «ГосНИИгенетика»).
Индустриальный партнер: Закрытое акционерное общество «Завод Премиксов №1» (http://www.lysine31.ru/).
Участники консорциума (соисполнители): Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский химико-технологический университет имени Д.И. Менделеева» ФГБОУ ВПО «РХТУ имени Д.И. Менделеева»; Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Центр «Биоинженерия» Российской академии наук (Центр «Биоинженерия» РАН).
Цель проекта:
1) Создание эффективной кормовой базы для развития отечественного животноводства и птицеводства на основе продуктов биотехнологии – незаменимых аминокислот, получаемых ферментацией возобновляемого сырья. Преодоление зависимости российских производителей мяса от импортных поставок аминокислот.
2) Создание необходимого и достаточного научно-технического задела в области конструирования на основе полногеномного анализа и метаболической инженерии промышленных штаммов микроорганизмов-суперпродуцентов незаменимых аминокислот, предназначенных для производства кормовых добавок для сельского хозяйства.
Основные результаты проекта:
по этапу 1 (14.11.2014-31.12.2014):
На основании анализа научно-технической и патентной литературы осуществлен выбор решений по конструированию штамма-суперпродуцента лизина, которые заключаются в последовательном введении в геном штамма Brevibacterium flavum направленных изменений, затрагивающих основные этапы синтеза лизина, его предшественников, транспорта глюкозы и образование побочных продуктов с использованием методов метаболической инженерии. В результате реализации этой стратегии получены производные штамма Brevibacterium flavum 90 с повышенной активностью ферментов конечных стадий биосинтеза лизина - аспартаткиназы, диаминопимелат дегидрогеназы, дигидропиколинат редуктазы и дигидродипиколинат синтазы, диаминопимелатдекарбоксилазы. Оценка продуктивности мутантных штаммов в колбах показала, что увеличение активности каждого из этих ферментов за счет усиления экспрессии кодирующих их генов приводит к росту продуктивности по лизину на 35-45% по сравнению с исходным штаммом. Осуществлено секвенирование генома базового штамма Brevibacterium flavum для конструирования, что позволит на последующих этапах выполнения проекта выявить новые мутации, повышающие продуктивность по лизину создаваемых штаммов. Научно-технический уровень результатов ПНИЭР соответствует проводимым в мире технологическим разработкам. Технологические решения в области конструирования штаммов и разработки технологического процесса получения лизина с помощью ферментации возобновляемого сырья, которые будут разработаны в ходе выполнения проекта, позволят получить новый продукт для сельского хозяйства – аминокислотную кормовую добавку с содержанием L-лизина сульфата не менее 75%, что превышает показатели мировых аналогов. На основании анализа научной и патентной литературы обоснованы пути использования побочного продукта переработки зерна пшеницы – пентозановой фракции в качестве основы для культивирования дрожжей и получения белковой кормовой добавки.
по этапу 2 (01.01.2015-30.06.2015):
С использованием методов генетической и метаболической инженерии впервые получена серия мутантных штаммов производных B. flavum 90 с разным набором генетических модификаций, изменяющих активность ключевых ферментов биосинтеза лизина, синтеза предшественников лизина, синтеза кофактора НАДФН, адаптированных для новой сырьевой базы – продуктов переработки зерна пшеницы. На основании сравнительной оценки ростовых характеристик и эффективности синтеза лизина (в т.ч. максимальной концентрации лизина в культуральной среде, скорости синтеза лизина (объемной продуктивности) и коэффициента конверсии) в колбочных экспериментах и в лабораторных ферментерах емкостью до 3 л, осуществлен выбор штамма, обладающего наилучшими показателями в условиях стандартного теста. Созданный на данном этапе штамм B. flavum Н75, содержащий генетические модификации ключевых генов биосинтеза лизина, генов синтеза предшественников лизина, и синтеза кофактора НАДФН продуцирует на 80% больше лизина, чем исходный штамм B. flavum 90, использованный для направленного конструирования. Впервые осуществлено секвенирование генома мутантного штамма Brevibacterium flavum 90 с повышенной продуктивностью по лизину; полученного традиционными методами мутагенеза и отбора, что открывает возможности для сравнительного анализа геномов базового и мутантного штаммов и выявления на последующих этапов работы генетических модификаций, повышающих продуктивность по лизину создаваемых штаммов. С целью снижения затрат на производство лизина, побочный продукт переработки зерна пшеницы – пентозановая фракция - была использована для выращивания дрожжей с целью получения белковой кормовой добавки. На основании таких критериев как продуктивность и биологическая ценность биомассы был осуществлен выбор наиболее перспективных штаммов дрожжей, утилизирующих сахара пентозановой фракции. Выполнен комплекс исследований, касающихся важнейших элементов технологического процесса биосинтеза лизина, включая устранение пенообразования, подготовку посевного материала для промышленной ферментации, способы введения факторов роста при биосинтезе лизина. Наиболее эффективным способом преодоления пенообразования при увеличении загрузки ферментера является комплексный подход, основанный на применении синтетического пеногасителя (лапрол 3003, лапрол ПД1, Бреокс ФМТ, пропинол Б-400) и механического пеногашения. Комбинированные способы введения факторов роста (гидролизат глютена и кукурузный экстракт) в составе питательной среды и в составе подпитки в процессе биосинтеза обеспечили максимальный уровень продукции лизина. Полученные результаты соответствуют техническим требованиям проекта. Перечень используемых методов и результаты ПНИЭР соответствуют мировому уровню развития данной области.
Результаты выполнения проекта были представлены на V Международном форуме «Большая химия» (21-22 мая 2015 г., Уфа), VIII Московском международном конгрессе «БИОТЕХНОЛОГИЯ: СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ» и XIII международной специализированной выставке «МИР БИОТЕХНОЛОГИИ' 2015» (17-20 марта 2015 г., Москва) и на 20-й международной специализированной торгово-промышленной выставке «Зерно-Комбикорма-Ветеринария-2015» (27-29 января 2015 г., Москва).
по этапу 3 (01.07.2015-31.12.2015):
С использованием методов генетической инженерии получены генетические конструкции, с помощью которых в хромосоме штамма B. flavum проведены модификации генов, контролирующих транспорт глюкозы в клетку и синтез компонентов клеточной стенки. Впервые получена серия мутантных штаммов производных B. flavum 90 с разным набором генетических модификаций, изменяющих активность ключевых ферментов биосинтеза лизина, синтеза его предшественников, транспорта глюкозы, а также изменяющих структуру клеточной стенки, адаптированных для новой сырьевой базы – продуктов переработки зерна пшеницы. На основании сравнительной оценки ростовых характеристик и эффективности синтеза лизина (в т.ч. максимальной концентрации лизина в культуральной среде, скорости синтеза лизина (объемной продуктивности) и коэффициента конверсии) в экспериментах на колбах выявлены комбинации генетических модификаций, повышающих продукцию лизина измененными штаммами. В экспериментах с использованием лабораторных ферментерах емкостью до 3 л осуществлен выбор штамма, обладающего наилучшими показателями, и проведена оценка его биотехнологического потенциала. Созданный на данном этапе штамм B. flavum Н115, содержащий 9 разных модификаций ключевых генов биосинтеза лизина, превышает предшествующий уровень синтеза лизина не менее чем на 10%. Разработан проект технологической операции «Биосинтез лизина» на основе экспериментов в лабораторных ферментерах (емкостью до 3 л) с использованием типового сырья и полученного на этапе штамма Н115.
На основе сравнительного анализа геномов базового и мутантного штаммов, впервые секвенированных в ходе выполнения данного проекта, выявлено 377 отличий в геномах, в том числе затрагивающих 24 гена, вовлеченных в контроль синтеза лизина, которые рассматриваются в качестве генов-мишеней для модификации с целью дальнейшего повышения продукции лизина.
С целью снижения затрат на производство лизина, продолжены работы по утилизации побочного продукта переработки зерна пшеницы – пентозановой фракции. Проведена оптимизация условий и состава сред для выращивания дрожжей на пентозановой фракции, разработан лабораторный регламент изготовления белковой кормовой добавки.
Выполнен комплекс исследований, касающихся важнейших элементов технологического процесса изготовления аминокислотной кормовой добавки, включая технологические операции, связанные с выбором, оценкой качества и подготовкой сырья для ферментации, разработки видов и режимов подпитки при проведении ферментации в лабораторных ферментерах. Осуществлена доработка проекта технологической операции «Биосинтез лизина» с учетом промышленного сырья, включая глюкозную патоку и гидролизат глютена, получаемые из зерна пшеницы Индустриальным партнером в собственном производстве. Полученные результаты соответствуют техническим требованиям и плану-графику выполнения работ. Перечень используемых методов и результаты ПНИЭР соответствуют мировому уровню развития данной области.
Результаты выполнения проекта были представлены на IX Международной научной конференции, посвященной 50-летию создания Института микробиологии НАН Беларуси "Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты" (7-11 сентября 2015 г., Минск, Беларусь); на III Международном форуме "БИОКИРОВ-2015" (17-19 сентября 2015 г., Киров, Россия); а также обсуждались на круглом столе «Современные биотехнологии: от фундаментальной науки к практическому использованию» (13 октября 2015 г., Москва, Россия, «Парламентская газета»).
по этапу 4 (01.01.2016-30.06.2016)
С использованием методов метаболической инженерии получены генетические конструкции, с помощью которых в хромосоме штамма B. flavum проведены модификации генов, контролирующих образования побочных по отношению к синтезу лизина продуктов клеточных метаболитов. Впервые получена серия мутантных штаммов производных B. flavum 90 с разным набором генетических модификаций, в т.ч. с инактивированными генами alaT и avtA пути биосинтеза аланина; с инактивированным геном ldhA пути биосинтеза молочной кислоты; инактивированным геном pox пути биосинтеза уксусной кислоты; мутантным геном ilvN биосинтеза разветвленных аминокислот; мутантным геном murA по синтезу пептидогликана; инактивированным геном системы транспорта глютамата из клетки. Кроме того получены производные штамма Brevibacterium flavum с измененной активностью цикла трикарбоных кислот, с изменениями в комплексе элонгации трансляции и с высокой аспартазной активностью.
Эксперименты в колбах позволили выявить комбинации генетических модификаций, обеспечивающих высокий уровень продукции лизина. Исследование продуктивности полученного штамма в лабораторных ферментерах емкостью до 3 л продемонстрировало высокий биосинтетический потенциал штамма. Созданный на данном этапе штамм B. flavum Н150 в условиях лабораторного ферментера обладает важнейшими характеристиками, соответствующими всем требованиям ТЗ. С использованием полученного штамма разработан лабораторный регламент изготовления аминокислотной кормовой добавки- L-лизин сульфат. Разработанный регламент позволяет получать конечный продукт с содержанием лизин сульфата 75%, не имеющий аналогов на рынке кормовых добавок. Разработана программа испытаний и проведены исследовательские испытания, которые подтвердили основные характеристики процесса и качества продукции. Вместе с тем обнаружено, что увеличение масштаба ферментации (с 3 л до 42 л) привело к увеличению длительности ферментации, что обуславливает необходимость доработки стадии масштабирования при биосинтезе лизина.
Проведено секвенирование и идентифицированы генетические изменения штамма-продуцента лизина. На основе сравнительного геномного анализа разработан генетический паспорт промышленного штамма Н150, позволяющий однозначно идентифицировать штамм. С целью снижения затрат на производство лизина, продолжены работы по утилизации побочного продукта переработки зерна пшеницы – пентозановой фракции. Разработана программы испытаний технологического процесса изготовления белковой кормовой добавки на основе пентозановой фракции. Для испытаний наработаны опытные образцы белковой кормовой добавки (БКД).
Выполнен комплекс исследований, касающихся коммерциализации результатов ПНИЭР: проведено масштабирование процесса биосинтеза лизина в 1500 л ферментере в условиях пилотной установки индустриального партнера, наработаны опытные партии кормовой добавки Лизин-75 для исследования безопасности и эффективности кормовой добавки, разработаны ТУ на кормовые добавки (Лизин-75 и БКД), проведены токсикологические исследования кормовых добавок на лабораторных животных. Отмечена необходимость доработки стадии масштабирования биосинтеза лизина.
по этапу 5 (01.07.2016-30.12.2016)
С использованием методов метаболической инженерии созданы генетические конструкции, с помощью которых в хромосоме штамма B. flavum проведены модификации генов, контролирующих конечные стадии биосинтеза лизина, синтез предшественников лизина, транспорт глюкозы в клетку, образование побочных продуктов. Генетические модификации включали делеции генов, замену собственных промоторов генов на конститутивные промоторы, замену сайтов инициации трансляции и замены в структурной части генов, приводящие к снятию ингибирования активности ферментов, кодируемых этими генами. Всего было модифицировано свыше 20 генов, вовлеченных в контроль биосинтеза лизина в клетках B. flavum. Тестирование мутантных штаммов в колбах и лабораторных ферментерах позволило выявить комбинации генетических модификаций, которые обладали максимально выраженным эффектом на продуктивность штаммов по лизину. В результате был получен штамм B. flavum Н150, который в условиях лабораторных ферментаций обладал важнейшими характеристиками, в полной мере соответствующими требованиям Технического задания. С использованием полученного штамма разработан лабораторный регламент изготовления аминокислотной кормовой добавки L-лизин сульфат. Разработанный регламент позволяет получать конечный продукт с содержанием лизин сульфата 75%, не имеющий аналогов на рынке кормовых добавок. На завершающей стадии создания промышленного штамма-суперпродуцента лизина с помощью методов молекулярно диагностики и секвенирования продемонстрирована высокая стабильность генетической структуры штамма при хранении и использовании в ферментационных процессах. Проведены исследования стабильности трех опытных образцов аминокислотной кормовой добавки – L-лизин кормовой (Лизин-75), наработанных в период с 10 мая 2016 г. по 31 мая 2016 г. в соответствии с Лабораторным регламентом ЛР-00479942-1-2016 в ФГУП «ГосНИИгенетика». В процессе хранения этих образцов в ФГУП «ГосНИИгенетика» при следующих параметрах - температуре воздуха +15 +25 ºС и относительной влажности воздуха – не более 70%, анализировались орагнолептические, физико-химические, бактериологические и санитарные показатели образцов АКД и их соответствие показателям ТЗ.
Проведен анализ и обобщение результатов полногеномного секвенирования объектов работы - 3 штаммов коринебактерий (базового, мутантного и промышленного штаммов), использованных в работах по генетическому конструированию. Результаты этого анализа подтвердили правильность выбранной стратегии по конструированию, основанной на сочетании направленных модификаций генома и случайных мутаций, полученных в ходе мутагенеза.
С целью снижения затрат на производство лизина, выполнен комплекс работ по микробиологической утилизации побочного продукта переработки зерна пшеницы – пентозановой фракции. Проведены исследовательские испытания белковой кормовой добавки и технологии её изготовления (ТБКД), которые показали полное совпадение с требованиями Технического задания. Разработано техническое задание на выполнение ОТР по разработке промышленной технологии изготовления БКД. Выполнен комплекс исследований, касающихся коммерциализации результатов ПНИЭР. Разработан способ длительного хранения рабочих партий промышленного штамма и создан криобанк рабочих партий для Индустриального партнера. На базе пилотной установки Индустриального партнера с использованием 1500 л ферментера и промышленного сырья разработан опытно-промышленный регламент изготовления аминокислотной кормовой добавки. Разработана программа предварительных испытаний и проведены испытания ОПР ТАКД в условиях пилотной установки Индустриального партнера, которые показали необходимость доработки технологической операции биосинтеза лизина в условиях промышленного производства. С целью подготовки регистрации АКД Лизин-75 выполнены исследования по обоснования гигиенических нормативов (ПДК) для штамма-продуцента лизина B. flavum Н150 в воздухе рабочей зоны и атмосферном воздухе населенных мест, а также на примере разных сельскохозяйственных животных (свиньи, кролики, птица и рыбы) показана высокая эффективность L-лизина сульфата, применяемого в качестве компонента корма. отмечено, что L-лизин сульфат производства ЗАО «Завод премиксов №1» превосходит по эффективности импортную кормовую добавку - лизин гидрохлорид, применяемую в настоящее время в хозяйствах Российской Федерации.
