Соглашение № 14.625.21.0005
о предоставлении субсидии
в рамках реализации ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014 - 2020 годы»
Мероприятие 1.3, 13 очередь
Шифр 2014-14-579-0059
№ госрегистрации – 114100640050
Соглашение о предоставлении субсидии
от «25» августа 2014 г. № 14.625.21.0005
Тема «Разработка генетических конструкций для получения генно-инженерных продуцентов термостабильной альфа-амилазы и янтарной кислоты», согласно техническому заданию и календарному плану по Соглашению о предоставлении субсидии, осуществлен следующий комплекс работ.
В рамках выполнения проекта:
Разработаны генно-инженерные подходы для последовательного направленного внесения множественных изменений в геном дрожжей S. pombe. На данном этапе работ были сконструированы интегративные векторы с доминантным селективным маркером KmMX, обеспечивающим клеткам устойчивость к генетицину (G418), и геном URA4 из дрожжей S. pombe, комплементирующим ауксотрофность по урацилу в штаммах с мутантным геном URA4. Векторы содержат lox-сайты или прямые повторы для последующего удаления селективного маркера из генома. На основе сконструированных векторов созданы плазмиды, содержащие кассеты для направленной интеграции в локусы PDC3, URA4, Ku70 и Ku80 дрожжей S. pombe. Сконструированы интегративные экспрессионные векторы, содержащие сильные промоторы CMV (цитомегаловируса человека) или adh (гена алкогольдегидрогеназы дрожжей S. pombe) и терминатор TbGH-polyA, а также сайты рестрикции для клонирования флангов для гомологичной рекомбинации в геном дрожжей. Также оптимизированы методики трансформации для штамма S. pombe ВКПМ Y-285.
Для проведения направленных изменений в геноме дрожжей S. pombe для модификации метаболизма по пути усиления восстановительной цепи цикла трикарбоновых кислот были синтезированы гетерологичные гены MDH и FUM из Rhizopus oryzae, FRDg и FRDm из Trypanosoma brucei. Предварительно синтезу генов была проведена работа по оптимизации кодонов для эффективной трансляции в клетках дрожжей S. pombe, исключению последовательностей, кодирующих сигналы для транспорта белков в митохондрии или глиоксисомы. Синтезированные гены клонированы в вектор pUC57.
Работы, выполненные во втором этапе в рамках ПНИ по разработке и созданию инструментария, позволили улучшить методическую базу для работы с дрожжами S. pombe. Полученные наработки могут быть использованы как для проведения научных исследований на дрожжах S. pombe, так и для конструирования штаммов-продуцентов промышленно ценных целевых продуктов.
Для разработки конкурентноспособной технологии получения янтарной кислоты микробиологическим синтезом является критичным использование недорогих непищевых субстратов, образуемых в результате биоконверсии крахмалсодержащего растительного сырья высокоактивными термостабильными ферментами, в частности альфа-амилазами.
В ходе выполнения этапа 2 проекта был получен рекомбинантный штамм B. subtilis ВКПМ В-12240 – продуцент термостабильной альфа-амилазы с производительностью не менее 200 ед./мл культуральной жидкости при ферментации не более 30 часов. Штамм В-12240 сконструирован на основе беспротеазного штамма AJ73 В-5036, в котором экспрессировали ген термостабильной альфа-амилазы из B. licheniformis B-9612 под собственным промотором. В ходе создания штамма была сконструирована плазмида, содержащая гомологию к 16S-РНК B. subtilis и способная к многокопийной интеграции в геном реципиента. Штамм B. subtilis ВКПМ Y-12240 продуцирует в культуральную жидкость активную термостабильную альфа-амилазу. Таксономическая принадлежность полученного штамма к виду Bacillus subtilis была подтверждена по анализу 16S РНК.
Установлены оптимальные параметры культивирования штамма-продуцента B. subtilis ВКПМ Y-12240 для получения ферментного препарата с максимальной активностью, включающие подбор температуры и состава сред, определение температурного и рН оптимумов действия фермента термостабильной альфа-амилазы.
Была отработана методика измерения активности альфа-амилазы. Альфа-амилаза, продуцируемая рекомбинантным штаммом B. subtilis ВКПМ В-12240, характеризуется такими промышленно ценными свойствами, как высокая удельная активность и стабильность в интервале температур 80-110°С, с температурным оптимумом 90оС, что обеспечивает ферментативный гидролиз крахмала без промежуточной термообработки.
Для штамма-продуцента B. subtilis ВКПМ Y-12240 разработаны Программа и методики испытаний экспериментальных образцов штамма и продуцируемого им ферментного препарата термостабильной альфа-амилазы и проведены испытания штамма и ферментного препарата. Были наработаны экспериментальные образцы рекомбинантного штамма B. subtilis ВКПМ Y-12240 и ферментного препарата термостабильной альфа-амилазы.
Были проведены испытания штамма продуцента B. subtilis ВКПМ В-12240 и ферментного препарата термостабильной альфа-амилазы. Определение активности термостабильной альфа-амилазы проводилось в соответствии с требованиями ГОСТ Р 54330-2011.
Было проведено масштабирование процесса культивирования продуцента термостабильной альфа-амилазы B. subtilis.
Полученный продуцент термостабильной альфа-амилазы на основе штамма B. subtilis синтезирует и секретирует в среду культивирования целевой продукт – фермент альфа-амилазу и может быть использован для наработки активного фермента для гидролиза крахмала в промышленных масштабах. Осахаренный крахмал служит источником углерода и может применяться как компонент сред для культивирования рекомбинантных продуцентов.
На данном этапе выполнен запланированный комплекс внебюджетных работ, направленных на разработку технико-экономического обоснования производства сахаросодержащего сырья и янтарной кислоты, которое составлено на основании предложений от инжиниринговых компаний, и проведена закупка стандартного оборудования для создания биотехнологической возможности производства янтарной кислоты с использованием штаммов микроорганизмов. Проведено изготовление нестандартного оборудования для модельной установки культивирования штамма-продуцента.
Таким образом, поставленные на этапе 2 задачи решены в полном объёме. Полученные наработки будут использованы для выполнения последующих этапов технического задания по лоту «Разработка конкурентоспособного способа получения янтарной кислоты микробиологическим синтезом из возобновляемого сырья для производства биоразлагаемых пластиков и дефицитных химикатов».
