Соглашение № 14.610.21.0011 от 03.10.2017

в рамках мероприятия 1.3 ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы»

Номер Соглашения о предоставлении субсидии:   14.610.21.0011 от 03.10.2017

Тема:  «Создание микробных биофабрик на основе редактирования геномов промышленных микроорганизмов, обеспечивающих высокотехнологичное производство кормовых добавок для достижения продовольственной безопасности страны»

Уникальный идентификатор соглашения:   RFMEFI61017X0011

Получатель субсидии / Исполнитель:   НИЦ «Курчатовский институт» – ГосНИИгенетика

Индустриальный партнер:   Закрытое акционерное общество «Завод Премиксов №1»  ( http://www.lysine31.ru/ ).

Участники консорциума (соисполнители):   Белгородский государственный университет

Цель проекта:   Разработка комплекса методов по метаболическому инжинирингу промышленных микроорганизмов, обеспечивающих перенаправление метаболических потоков клетки в сторону образования продуктов с высоким рыночным потенциалом, востребованных в сельском хозяйстве и создание штамма Escherichia coli – суперпродуцента L-треонина, обеспечивающего конкурентоспособность разрабатываемого технологического процесса получения АКД "Треонин гранулированный" и АКД "Треонин кристаллический".

Основные результаты проекта:

по этапу 1 (03.10.2017 - 31.12.2017):

•  Разработаны основные подходы и генетические инструменты, позволяющие осуществлять введение в геном штамма специальных генетических модификаций, повышающих продукцию треонина клеток E. coli, в т.ч. для направленного изменения экспрессии и инактивации генов E. coli.

•  Разработан модельный процесс культивирования базового продуцента треонина для экспериментальной оценки влияния вносимых генетических модификаций на биосинтез треонина.

•  Внесены генетические модификации треонинового пути синтеза и проведена их оценка. Проведено тестирование усовершенствованных систем для инактивации хромосомальных генов и удаления генетических маркеров, а также сверхэкспрессию генов. Сконструированные праймеры позволили определить мишени и получить генетические модификации в треониновом пути синтеза клеток E. coli.

•  Индустриальным партнером проекта ЗАО "Завод Премиксов №1" наработаны опытные партии субстратов с использованием продуктов глубокой переработки зерна пшеницы - глюкозной патоки, полученной с использованием крахмала А и В для проведения дальнейших исследовательских испытаний.

по этапу 2 (01.01.2018 - 31.12.2018):

•  Подготовлены Комплекты технической документации на изготовление и изготовлены экспериментальные стенды №1, №2 и №3. С использованием экспериментальных стендов проведены следующие работы:

•   Разработаны генетические конструкции для введения направленных модификаций в центральный метаболизм, транспорта треонина из клетки, транспорта треонина в клетку, деградации треонина, оптимизации биомассы клеток, транспорта аммония в клетку и реакций аминирования. Используя данные конструкции было внесено более ста модификаций в 68 генов, затрагивающих биосинтез треонина в клетках E. сoli.

•   Разработаны и проведены исследовательские испытания штаммов для каждой группы модификаций с применением культивирования в пробирках и ферментере объемом 3 л.

•   Полностью определена первичная нуклеотидная последовательность генома штамма E. coli K-12 ВКПМ В-11161, не подвергавшегося обработке мутагеном. На основе данного штамма произведена сборка модификаций, обладающих наибольшим эффектом на продукцию треонина.

•   Отработаны методики консервирования образцов культуры штамма E. coli – суперпродуцента L-треонина и подготовки посевного материала.

•   Разработаны требования к сырью, типы и режимы подпитки и пеногашения при культивировании продуцента при получении L-треонина.

по этапу 3 (01.01.2019 - 31.12.2019):

•  Секвенирован геном штамма Escherichia coli  БРЦ ВКПМ B-13427 – суперпродуцента L-треонина, который при ферментации в ферментере в культуральной жидкости аккумулирует более 118 г/л L-треонина за 36 ч. культивирования при конверсии глюкозы более 50%.

•  В ходе выполнения проекта были разработаны ПМ 02, 03, 04 и проведены испытания по разработанным ПМ Технологических операций ТО-1, ТО-2, ТО-3, ТО-4, ТО-6 и ТО-7.  На основании выполненных работ были разработаны лабораторные регламенты:

- ЛР-00479942-2019,

- ЛР-00479942-2-2019 (редакция 2) после проведения процесса биосинтеза,

- ЛР-00479942-3-2019 (редакция 3) после проведения процесса сушки,

- ЛР-00479942-4-2019 (редакция 4) после проведения процесса кристаллизации;

- ЛР-00479942-4-2019 (редакция 5) после проведения процесса масштабирования.

•  Разработаны опытно-промышленный регламент ТП АКД ОПР -00479942-2019 и его редакции ОПР-00479942-2-2019 по результатам предварительных испытаний и ОПР-00479942-3-2019 по результататам приемочных испытаний.

•  Проведены токсикологические и кормовые исследования АКД «Треонин гранулированный» и АКД «Треонин кристаллический». Проведены исследования эффективности АКД «Треонин гранулированный» и АКД «Треонин кристаллический» в рационах кормления птицы и свиней.

•  Проведены дополнительные патентные исследования, технико-экономическая оценка рыночного потенциала полученных результатов, а также разработаны рекомендации по возможности использования результатов, проведенных ПНИЭР в реальном секторе экономики.