Соглашение № 14.579.21.0013
в рамках мероприятия 1.3 ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014 - 2020 годы».
№ госрегистрации – 114082840014
Соглашения о предоставлении субсидии: № 14.579.21.0013 от 05.06.2014 г.
Тема: «Разработка конкурентоспособной технологии получения L-молочной кислоты без промежуточного образования солей на основе использования рекомбинантных штаммов дрожжей»
- 1. Цель проекта
Целями выполнения работ являются:
Разработка масштабируемого лабораторного процесса получения L- молочной кислоты на основе рекомбинантного штамма – продуцента дрожжей Shizosaccharomyces pombe с ферментацией при низких значениях рН без промежуточного образования солей молочной кислоты
- 2. Основные результаты проекта
1) Разработаны вектора для исследования свойств L-лактатдегидрогеназ различного происхождения в клетках S.pombe. В полученные вектора клонированы гены лактатдегидрогеназ и созданы репликативные плазмиды pCMV-loxKm-ARS-bov, pCMV-loxKm-ARS-sap, pCMV-loxKm-ARS-rhiz, pCMV-loxKm-ARS-pla, pCMV-loxKm-ARS-pen. Подобраны условия для эффективной трансформации плазмид в клетки выбранных штаммов S. pombe, эффективность которой составила 1*104. Получены штаммы S.pombe, содержащие экспрессионные репликативные плазмиды с различными генами L-лактатдегидрогеназ из организмов: Bos taurus, Homo sapiens, Rhizopus oryzae, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus pentosus. Наличие генов лактатдегидрогеназ в полученных штаммах подтверждено методом ПЦР.
2) Проведено изучение кинетических характеристик реакций, катализируемых различными L-лактатдегидрогеназами. Выявлено, что наилучшими кинетическими характеристиками обладают лактатдегидрогеназы из R. oryzae, L. plantarum, L. pentosus.
3) Проведена оценка каталитической активности ферментов в клетках S. pombe. Выявлено, что наилучшей каталитической активностью обладают лактатдегидрогеназы из L. plantarum, L. pentosus.
На основании сравнения активностей прямой и обратной реакции были выбраны L-лактатдегидрогеназы из L. plantarum, L. pentosus и Homo sapiens.
4) Были выбраны гены, кодирующие наиболее активные L-лактатадегидрогеназы из организмов Homo sapiens, L. plantarum, L. pentosus.
5) Был сконструирован экспрессионый интегративный вектор pCMV-loxKm-Tf2. На основе вектора pCMV-loxKm-Tf2 были получены интеграционные плазмиды pCMV-sap-Tf2, pCMV-pla-Tf2, pCMV-pen-Tf2 для эффективной трансформации генов L- лактатдегидрогеназ Homo sapiens, L.plantarum, L. pentosus в хромосому клеток S.pombe.
6) Были разработаны вектора для эффективной множественной интеграции с использованием системы Piggybac выбранного гена лактатдегидрогеназы в хромосому клеток дрожжей S. pombe.
7) Трансформацией интегративных плазмид pCMV-sap-Tf2, pCMV-pen-Tf2, pCMV-pla-Tf2, содержащих гены L-лактатдегидрогеназ Homo sapiens, L. plantarum, L. pentosus, в клетки штамма S. pombe Y-3106 методом электропорации были получены рекомбинантные штаммы S. pombe SzLac-pla, SzLac-pen, SzLac-sap (генетические особенности Tf2::ldh pla, Tf2::ldh pen, Tf2::ldh sap). Полученные штаммы SzLac-pla, SzLac-pen, SzLac-sap продуцировали молочную кислоту в количестве 71, 62 и 10,5 г/л за 72 часа ферментации, соответственно. Таким образом, наиболее продуктивным явился штамм SzLac-pla, который не являются зоопатогенными, фитопатогенными и не представляет опасности по каким-либо другим причинам, так как относятся к непатогенным микроорганизмам, и согласно международной классификации и данным АТСС относится к первому уровню биобезопасности.
