Пэгилированный рекомбинантный гранулоцитарный колониестимулирующий фактор пролонгированного действия: новая схема получения активной фармацевтической субстанции

Автор: И.А. Пучков, Д.И. Баирамашвили, И.В. Мягких, В.И. Швец

Страница: 35-50

Пэгилированный рекомбинантный гранулоцитарный колониестимулирующий фактор пролонгированного действия: новая схема получения активной фармацевтической субстанции

Биотехнология, 2014, № 2, С. 35-50

УДК 577.112.083

Раздел:  «Технология биопрепаратов»

И.А. Пучков ^{1, *},  Д.И. Баирамашвили ²,  И.В. Мягких ³,  В.И. Швец ⁴

¹  Российская фармацевтическая компания ЗАО «Мастерклон»,  Москва, 119019

²  Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова,  Москва, 117997

³  Российская инновационная фармацевтическая компания ЗАО «Генериум»,  Москва, 123317

⁴  Московский государственный университет тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова,  Москва, 119571

e-mail:  poutchkov@mail.ru

В работе получена активная фармацевтическая субстанция пэгилированного препарата рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора Г-КСФ (филграстима), обладающего пролонгированным действием. Очистку осуществляли в четыре этапа. Первый этап (подготовительный) включал солюбилизацию белка из телец включения, его ренатурацию и ионообменную хроматографию на сорбенте SP-Sepharose FF при рН 6,0 для получения раствора рчГ-КСФ с концентрацией 12—15 мг/мл. На втором этапе осуществляли модификацию белка посредством селективного ковалентного присоединения молекулы α-метил-ПЭГ-пропиональдегида к α-аминогруппе N-концевого аминокислотного остатка метионина рекомбинантного Г-КСФ. На третьем этапе проводили основные стадии очистки ПЭГ-Г-КСФ c помощью гидрофобной хроматографии на Вutyl-Sepharose 4 FF при рН 7,0, гель-фильтрации на сорбенте Sephadex G-25 и ионообменной хроматографии на SP-Sepharose FF при рН 4,5. В заключительной части работы полученный препарат, соответствующий стандартам Европейской Фармакопеи, переводили в финальный буферный раствор с помощью гель-фильтрации на сорбенте Sephadex G-25. Таким образом была разработана технологическая схема, позволяющая получить препарат ПЭГ-Г-КСФ фармакопейного качества с выходом не менее 35% от исходного белка.

Ключевые слова:  гранулоцитарный колониестимулирующий фактор,  модификация,  полиэтиленгликоль,  филграстим,  хроматография.

----------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Pegylated Recombinant Granulocyte Colony-Stimulating Factor with Prolonged Mechanism of Action: a New Scheme for Active Pharmaceutical Substance Production

I.А. Puchkov ^{*, 1},  D.I. Bairamashvili ²,  I.V. Miagkikh ³,  and  V.I. Shvets ⁴

¹  The Russian Pharmaceutical Company Masterclone,  119019, Moscow Russia

²  The Shemyakin-and-Ovchinnikov Institute for Bioorganic Chemistry, Russ. Acad. Sci.,  117997, Moscow Russia

³  The Russian Innovative Pharmaceutical Company Generium,  123317, Moscow Russia

⁴  The Lomonosov Moscow University for Fine Chemical Technology,  119571, Moscow Russia

e-mail:  poutchkov@mail.ru

A production of an active pharmaceutical substance of the PEGylated recombinant granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF (Filgrastim), with a prolonged mechanism of action has been carried out in four stages. The first (preliminary) stage included the protein solubilization from inclusion bodies, renaturation and ion exchange chromatography on SP-Sepharose FF at pH 6.0 to obtain a solution with hrG-CSF concentration 12—15 mg/ml. The second stage was performed by the modification of the protein via the selective covalent attachment of α-methyl-PEG-propionaldehyde to α-amino group of the N-terminal methionine in the recombinant G-CSF. The third step consisted of basic purification procedures of PEG-G-CSF by hydrophobic chromatography on Butyl-Sepharose 4 FF at pH 7.0, size-exclusion chromatography on Sephadex G-25 and ion-exchange chromatography on SP-Sepharose FF at pH of 4.5. At the final stage, the obtained preparation (pure according to the European Pharmacopoeia) was transferred to a final buffer by the size-exclusion chromatography on Sephadex G-25. As a result, a technological scheme for the recombinant PEG-G-CSF manufacturing allowing to produce a pharmacopoeia quality preparation with the yield of at least 35% of the initially taken protein was developed.

Kew words:  chromatography,  Filgrastim,  granulocyte colony-stimulating factor,  modification,  poly(ethylene) glycol.

24.06.2014, 5577 просмотров.