Продукция моноклональных антител класса IgM в клетках DG44

Автор: М.А. Эршлер, Н.И. Оловникова

Страница: 24-34

Продукция моноклональных антител класса IgM в клетках DG44

Биотехнология, 2014, № 2, С. 24-34

УДК: 577.21

Раздел:  «Продуценты, биология, селекция, генетическая инженерия»

М.А. Эршлер *, Н.И. Оловникова

ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздрава России,  Москва, 125167

e-mail:  ershler@yandex.ru

Cозданы дву-бицистронные векторы для продукции рекомбинантных моноклональных антител класса IgM с использованием DHFR-негативной клеточной линии DG44. Использованные в работе векторы представляли собой тандемные конструкции, в которых один бицистрон кодировал легкую цепь иммуноглобулина и DHFR, а второй бицистрон — тяжелую цепь иммуноглобулина и EGFP. Такая структура вектора предполагает, что клетки, прошедшие селекцию и окрашенные зеленым белком, будут способны продуцировать обе цепи иммуноглобулина. Показано, что агглютинирующие антитела класса IgM мыши могут секретироваться в отсутствии J-цепи. Было обнаружено, что ключевую роль в экспрессии генов тяжелой и легкой цепей IgM играет наличие герминального лидерного пептида. Сравнение регуляторных элементов хроматина показало, что фланкирующие конструкцию инсуляторы 2xHS4 стабилизируют продукцию рекомбинантных антител, в то время как элемент прикрепления к клеточному матриксу 5'-MARLyz оказался менее эффективным. Стратегия получения продуцента на основе клеточной линии DG44 должна состоять из последовательных этапов: селекция на среде без нуклеозидов → амплификация встроенного гена → клонирование трансфектантов → отбор высокопродуктивных клонов. Попытка клонирования до амплификации и ам­плификация отдельных клонов не привели к получению эффективных продуцентов. Клонирование на среде без селекционного давления позволяет более адекватно оценивать стабильность продукции антител.

Ключевые слова:  амплификация,  вектор,  моноклональные антитела,  DG44,  IgM.

----------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Production of Monoclonal Antibodies of IgM Type in DG44 Cells

M.A. Ershler *,  and  N.I. Olovnikova

The Hematological Research Center, Ministry of Healthcare of RF,  125167, Moscow Russia

e-mail:  ershler@yandex.ru

Two-bicistronic vectors for the production of recombinant IgM monoclonal antibodies in the DG44 DHFR-negative cell line have been designed. We used tandem vectors in which one bicistronic unit encoded the immunoglobulin light chain and DHFR, whereas the other encoded the heavy chain and EGFP. The constructs structure presumes that green colored cells that survived selection would be capable of producing both immunoglobulin chains. We found out that the agglutinating IgM antibodies could be secreted in the absence of J peptide. It was shown that germinal leader peptide plays a key role in the expression of the genes for the light and heavy chains. A comparison of the chromatin regulatory elements demonstrated that construct-flanking 2xHS4 insulators stabilized the biosynthesis of the recombinant antibodies, whereas the 5'-MARLyz matrix attachment region proved to be less efficient. The strategy of obtaining of a DG44-based producer cell line should include the following consecutive steps: selection on the medium without nucleosides → amplification of the inserted gene → cloning of transfectants → selection of high-productive clones. An attempt to clone before amplification and amplify individual clones failed to result in effective producers. Cloning on a medium without selection pressure allows more adequate assessing of the stability of the antibody production.

Key words:  amplification,  DG44,  IgM,  monoclonal antibodies,  vector.

24.06.2014, 3509 просмотров.