Молекулярные технологии детекции возбудителя сибирской язвы посредством ПЦР различных форматов

Автор: O.Ю. Лиманская, Л.А. Муртазаева, S. Klee, А.П. Лиманский

Страница: 86-96

Молекулярные технологии детекции возбудителя сибирской язвы посредством ПЦР различных форматов

Биотехнология, 2013, № 3, С. 86-96

УДК 577.2:573.6

Раздел:  «Метрология, стандартизация, контроль»

O.Ю. Лиманская ^{1, 2, *},  Л.А. Муртазаева ¹,  S. Klee ³,  А.П. Лиманский ¹

¹  ГУ “Институт микробиологии и иммунологии им. И.И. Мечникова Национальной академии медицинских наук Украины”, Харьков, 61057

²  Национальный научный центр “Институт экспериментальной и клинической ветеринарной медицины Национальной
академии аграрных наук Украины”, Харьков, 61023

³  Институт Роберта Коха, Берлин, Германия, D-13353

e-mail:  olga.limanskaya@mail.ru

Точная идентификация бактерий Bacillus anthracis остается сложной задачей при идентификации возбудителя сибирской язвы на фоне близкородственных видов B. сereus и B. thuringiensis ввиду высокой степени подобия нуклеотидных последовательностей представителей группы Bacillus cereus sensu lato (Bacillus cereus s.l.), к которой принадлежат указанные микроорганизмы. В данном исследовании разработаны наборы праймеров и зонды для ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией для отличия бацилл B. аnthracis от B. сereus и B. thuringiensis, а также наборы праймеров для стандартной ПЦР с электрофоретической детекцией. Для представителей группы Bacillus cereus s.l. проанализированы нуклеотидные последовательности генов rpoB, plcr и ssp, содержащихся в хромосомной ДНК, которые могут являться молекулярно-генетическими маркерами для их типирования. Мишенью для праймеров и зондов определен фрагмент гена ssp хромосомной ДНК, характеризующийся гексануклеотидной вставкой только у штаммов B. аnthracis. Стандартная ПЦР с электрофоретической детекцией и разработанным набором праймеров позволяет надежно отличать бациллы B. аnthracis от близкородственных видов B. сereus и B. thuringiensis. Использование ПЦР-РВ с зондами в форматах TaqMan и молекулярного маяка также дает возможность проводить точную идентификацию бацилл B. аnthracis: сигнал флуоресценции для шпилечных проб в формате молекулярного маяка был положительным только для штаммов B. аnthracis, а для других представителей группы Bacillus cereus s.l. — отрицательным. При использовании линейных проб TaqMan регистрировали высокоинтенсивный сигнал флуоресценции для всех изолятов B. аnthracis и сигнал значительно более низкой интенсивности для других представителей группы Bacillus cereus s.l. Разработанные подходы могут быть полезными для клинических, эпидемиологических и эпизоотологических исследований.

Ключевые слова:  возбудитель сибирской язвы,  молекулярный маяк,  ПЦР в реальном времени,  стандартная ПЦР,  Bacillus anthracis.

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Molecular Technologies for Detection of Anthrax Causative Agent by PCR of Different Formats

O.Yu. Limanskaya ^{1, 2, *},  L.A. Murtazaeva ¹,  S. Klee ³,  and  A.P. Limanskii ¹

¹  The Mechnikov Institute of Microbiology and Immunology, Natl. Acad. Med. Sci. of Ukraine, 61057, Kharkov Ukraine

²  The National Scientific Center Institute of Experimental and Clinical Veterinary Medicine, Natl. Acad. Agrar. Sci. of Ukraine, 61023, Kharkov Ukraine

³  Robert Koch-Institut, D-13353, Berlin Germany

e-mail:  olga.limanskaya@mail.ru.

Accurate identification of Bacillus anthracis bacteria remains a challenge in discrimination of anthrax causative agent from closely related species of B. cereus and B. thuringiensis due to the high level of similarity of nucleotide sequences among the members of the Bacillus cereus sensu lato(Bacillus cereus s.l.) group, to which all the above bacteria belong. In this work, we have developed primer sets and probes for real-time PCR (RT-PCR) with fluorescence and hybridization detection for the discrimination of B. anthracis from B. cereus and B. thuringiensis and primer sets for conventional PCR with the electrophoretic detection. For the members of the Bacillus cereus s. l. group, the nucleotide sequences of the chromosomal rpoB, plcr, and ssp genes, which may be molecular genetic markers for their typing were analyzed. The fragment of the chromosomal ssp gene that was only characterized by a hexanucleotide insertion in B. anthracis isolates was identified as a target for the primers and probes. The conventional PCR with electrophoretic detection and designed primer set can reliably discriminate B. anthracis bacilli from the closely related B. cereus and B. thuringiensis species. Application of real-time PCR with TaqMan and molecular beacon probes also permits to carry out an accurate discrimination of B. anthracis from the closely related bacilli: the fluorescence signal for hairpin molecular beacon probes was only positive for the B. anthracis strains, and it was negative for other members of the Bacillus cereus s. l. group. Using the TaqMan linear probes, high-­intensity fluorescence signal was observed for all the B. anthracis isolates, whereas the signal of much lower intensity was fixed for the other members of the Bacillus cereus s. l. group.The developed approaches can be useful in clinical, epidemiological and epizootiological studies.

Key words:  anthrax causative agent,  Bacillus anthracis,  conventional PCR,  molecular beacon,  real-time PCR.

06.09.2013, 4622 просмотра.