Лекарь по имени паук

Лекарь по имени паук («ГосНИИгенетика»)

Сегодня существует много направлений в биотехнологии, которые еще не достигли промышленной реализации, но имеют такую перспективу через 5-10 лет. К числу таковых относится разработка искусственной паутины в Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ГосНИИгенетика).

О том, как происходила разработка нового метода микробиологического синтеза создания аналогов белков паутины, рассказывают научный руководитель института член-корреспондент РАН Владимир Георгиевич Дебабов и ведущий сотрудник лаборатории белковой инженерии кандидат биологических наук Владимир Григорьевич Богуш.

Дебабов В. Г.

— Наш институт постоянно работает над биотехнологическими методами получения волокон, которые обладают уникальным набором полезных потребительских свойств. К числу таковых относится и искусственная паутина.

В природе нить паутины в 5 раз прочнее стали, в 2 раза эластичнее нейлона, способна вытягиваться до 30% своей длины, обладает малой плотностью и низкой температурой стеклования. По мнению специалистов — это идеальный материал для парашютного корда, бронежилетов, шовных нитей в хирургии. Но одна самка (а именно самки плетут паутину) может выработать одноразово только 30-35 метров паутины, после чего должна отдыхать несколько дней. Поэтому промышленное количество паутины не могут быть получены с помощью самих пауков. Для того, чтобы решить эту задачу «ГосНИИгенетика» пятнадцать лет назад начал работу по клонированию белков паутины.

Богуш В. Г.

— Чтобы получить материал для клонирования была предпринята экспедиция в Южное Приморье. Именно там обитают самые крупные пауки — крестовики Уемуры. Их отловили на острове Попова в бухте Золотой Рог под Владивостоком.

Отловленные пауки использовались для получения паутинных нитей из больших ампуловидных желез, а также для выделения самих ампуловидных желез. «Доение» паука проводили после его фиксации с помощью специально разработанной методики, позволяющей получать каркасную нить паутины только из одной из передних бородавок, изолировав все остальные. Для этого тонким глазным пинцетом под бинокулярной лупой раздражали передние паутинные бородавки, вытягивали начало нити и закрепляли на стеклянной палочке, закрепленной в электрической дрели. Дрель включали на короткие промежутки времени. В большинстве случаев паутинные бородавки успешно продуцируют паутину. Однако если паук ослаблен голоданием или стрессом, паутина быстро обрывается. Для выделения самих желез была применена оригинальная методика быстрого замораживания пауков при температуре -25 градусов.

Дебабов В. Г.

— Полученная сухая паутина была использована для определения N-концевой последовательности аминокислот по методу Эдмана. К сожалению, получить достоверные результаты не удалось. По-видимому, это связано с наличием у этого белка «рваных концов», о чем свидетельствуют также данные других исследований.

Ампуловидные железы, выделенные из замороженных пауков, использовали для получения из них суммарной информационной РНК. При этом предполагалось, что она будет обогащена иРНК спидроинов. С помощью обратной транскрипции был синтезирован фрагмент гена спидроина 1 и клонирован в клетках Escherichia coli. Однако фрагмент клонированного гена оказался слишком маленьким и поэтому в дальнейшем для конструирования генов мы использовали последовательность спидроинов, опубликованные в научной печати.

Богуш В. Г.

— На первом этапе проекта (1999-2000г.г.) мы сосредоточились на получении спидроина 1. Каркасная нить паутины состоит из двух белков -спидроинов — 1 и 2, и именно первый, как считается, отвечает за прочность. Удалось синтезировать ген, кодирующий фрагмент спидроина 1 размером 400 пар нуклеотидов. Ген в составе плазмиды перевели в клетки дрожжей Saccharomices cerevisiae и убедились в том, что внутри дрожжевой клетки он работает — дрожжи продуцируют белок. Были разработаны оригинальные методы для выделения и очистки рекомбинантных белков, и с их помощью наработали уже несколько граммов продукта.

Очищенный белок нужно растворить, что само по себе задача непростая. Ведь белковый раствор такой 40% концентрации нельзя получить обычным способом. Для получения белка использовали соль роданид натрия, и таким образом получили так называемый прядильный раствор. А из него нужно было спрясть нитку, как это делает паук. Для этого мы разработали специальные методы и получили нить, которая, правда, не обладая еще прочностью природной паутины, по эластичности уже с ней сопоставимы.

Дебабов В. Г.

— На втором этапе выполнения проекта (2002-2004г.г.) исследователи стали параллельно работать и над получением рекомбининтного спидроина 2. Структура большей части этого белка известна, но чрезвычайно сложна. Прежде чем синтезировать ген для спидроина 2 надо было тщательно проанализировать последовательность аминокислот в молекуле. За дело взялись математики, которые выявили в цепочке сложную картину периодичности элементов последовательности. Благодаря этому молекулу оказалось возможным разделить на блоки-мономеры и работать с каждым из них.

Богуш В. Г.

— Таким путем мы собираем ген. Это очень длительная работа. Ее конечный результат — получение полного аналога природного гена спидроина 2.

Дебабов В. Г.

— В процессе работы над этим геном мы получили рекомбинантный белок — аналог спидроина 2, синтезировав ген, кодирующий один из его фрагментов. Причем теперь мы применяем другой вид дрожжей Pichia pastoris, специальный штамм которых идеально подходит для биологических манипуляций благодаря особой мутации.

Дрожжи растут и нарабатывают белок в специальном аппарате — ферментере. Через несколько суток суспензию с готовым продуктом частично сливают, доливают свежую культуральную среду, и цикл повторяется.

Богуш В. Г.

— Наличие белка в дрожжевых клетках проверяют методом электрофореза в полиакриламидном геле: на геле появляется полоска белка, положение которой соответствует его молекулярной массе. Из одного килограмма влажных клеток дрожжей получается приблизительно 100 миллиграммов чистого белка.

Прядение нити в лабораторных условиях — занятие нелегкое. Сначала спидроин растворяют в специальной смеси соли и уксусной кислоты. Получается вязкий раствор, капельку которого помещают в специально сконструированный сосуд с крошечным отверстием. Через него прядильный раствор медленно выдавливают в стакан со спиртом. В этаноле эта струйка превращается в тонкую нить, которая свободно падает на дно сосуда.

По времени весь процесс занимает два дня. В принципе из этого материала можно было бы делать даже бронежилеты, но для этого потребовалось бы синтезировать десятки килограммов материала. Но в лабораторных условиях такого количества не удается вырабатывать. Зато его вполне достаточно для медицинских целей.

Дебабов В. Г.

— Совершенно верно. Наша искусственная паутина просто незаменима в медицине. Ведь искусственные нити растягиваются почти так же, как природные. Кроме того, они превосходят по энергии разрыва сухожилия и кости. Они биосовместимы с тканями человека (не отторгаются) и характеризуются медленной биорезорпцией (рассасыванием в организме и постепенной заменой на натуральные ткани).

Из белка можно сделать не только нити, но и пленки. Именно в таком виде их реально можно использовать для изготовления заживляющих покрытий для ран и ожогов, которые не будут отторгаться организмом, стимулируя регенерацию собственного эпителия. Эксперименты на культуре клеток подтвердили, что пленки. Изготовленные из рекомбининтного белка паутины, нетоксичны.

Богуш В. Г.

— Прелесть этого материала в том, что он пористый. А это очень ценно для лечения ожогов. С одной стороны, пленка не пропускает бактерии, то есть обеспечивает стерильность, а с другой, позволяет ране дышать, обеспечивая доступ кислорода. Например, если закрыть ожог полиэтиленом, то там все загниет. А на такие пленки можно «насажать» клеток, которые будут образовывать новую кожу и способствовать более быстрому заживлению.

Пористая структура делает этот материал пригодным и для выращивания стволовых клеток. Клетки его узнают и не отторгают при размножении. В дальнейшем его можно будет использовать и для выращивания искусственных органов, костей, сухожилий, тканей. Достаточно будет обеспечить клетку определенной питательной средой.

Дебабов В. Г.

— Еще одна сфера связана с адресной доставкой лекарств. Из паутины можно делать наноконтейнеры — пористые шарики, в которых будет помещаться лекарство. Например, при опухолях головного мозга можно будет без трепанации черепа вводить в мозг определенное количество лекарства, адресно атакующего раковые клетки.

Перспективность наших разработок очевидна. К счастью, у нас есть и производственные мощности, на которых сейчас разрабатываются препараты на основе коллагена и поликсибутирата. Там же можно будет делать и композиции с рекомбинантной паутиной. Будем выпускать опытные партии, проводить доклинические и клинические испытания по утвержденным схемам. Для этого нужны значительные средства. Поэтому мы приглашаем все заинтересованные структуры к сотрудничеству.

08.10.2009, 5136 просмотров.